EUCASTE.DEF9.3..4
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适用范围
EUCAST标准描述了用于测试产孢丝状真菌对抗真菌药物MIC的合适方法。MICs表示在规定测试条件下特定抗真菌药物的体外活性，并可与其他因素（例如药代动力学，药效学和耐药机制）结合用于患者管理。依据MIC值将霉菌对抗真菌药物的结果分为“敏感”（S）、“增加药物暴露敏感”（I）或“耐药”（R）[13，14]。此外，当MIC用于真菌的流行病学临界值（ECOFFs）时，MIC分布可用于定义野生型(WT)或非野生型(NWT)菌株。
本方法宗旨在于提供一种合适、简便、快速且经济的方法，用于测试丝状真菌的抗真菌药物的敏感性，并促进实验室之间实验结果的相互认可（如在特定范围内的一致性）。Rambali等报道丝状真菌的MIC测定受许多因素影响[15]。例如，伊曲康唑对曲霉菌的MIC受微量稀释孔的形状、接种浓度、温度和孵育时间的长短影响较大。由于实验室技术因素至关重要，因此本标准聚焦于测试条件，包括接种物的制备和接种物的量，孵育时间和温度以及培养基配方。
02
术语和定义
1、抗真菌药物：生物半合成或合成物质，可抑制霉菌生长或杀死霉菌。不包括消毒剂、防腐剂。2、抗真菌药物的性能
a、效能：测试物的抗微生物活性成分。效能用质量分数表示，单位为（mg/g）；或者表示为活性含量，单位为国际单位（IU）/克；或者表示为体积分数或质量分数，以百分比表示；或者表示为物质浓度（质量分数）每升测试物质的摩尔数。
b、浓度：规定体积中所含的抗菌药物的量。浓度用SI单位表示为mg/L。3、储备液：稀释用的初始溶液。4、最低抑菌浓度（MIC）：在规定的时间内抑制霉菌生长特定减少的抗菌药物最低浓度；MIC用mg/L表示。5、折点（BP）：MIC的特定值，可根据该值将真菌划分为“敏感”（S）、“增加药物暴露敏感”（I）或“耐药”（R）。折点可能会因环境变化（例如，常用药物剂量的变化）或出现补充数据/知识。
a、S-标准剂量敏感：当使用该药物的标准剂量方案治疗成功的可能性很高时，微生物被归类为“敏感”。
b、I–增加药物暴露敏感*：通过调整剂量或增加感染部位的浓度治疗成功的可能性很高时，微生物被归类为“增加药物暴露敏感”。
c、R-耐药：即使增加剂量，治疗失败的可能性很高，则微生物被归类为“耐药”。
*感染部位暴露剂量取决于给药方式、剂量、给药间隔、输注时间以及抗菌药物的组织分布和代谢途径。6、野生型（WT）：对待测的抗菌（抗真菌）药物没有检测到获得耐药性表型和突变性耐药机制的霉菌菌株。7、非野型（NWT）：对待测的抗菌（抗真菌）药物检测到获得性耐药表型或突变性耐药机制的霉菌菌株。
注释：
a、应用折点将霉菌耐药表型通分为S，I或R
b、通过流行病学界值(ECOFFs)在将霉菌的耐药表型定义为WT或NWT。
c、NWT微生物有一个或多个耐药机制，WT和NWT微生物可能对药物的临床治疗有反应，也可能没有反应，这取决于临床折点（MIC）的值。
d、野生型为WT≤zmg/L，非野生型为NWTzmg/L(z为ECOFF值)。ECOFF是菌株缺乏可检测耐药表型的最高MIC值。
e、ECOFF值一般不会更改，除非累积的MIC分布表明需要进行调整时。8、质控参考菌株：具有分类明确、特征稳定、有确切的耐药性表型和/或基因型的菌株。可从培养物收集物中获得，用于质量控制。9、药敏试验方法
a、肉汤稀释法：该技术是在液体培养基中制备抗真菌药物浓度系列稀释液（通常是2倍），接种标准数量的真菌并按规定的时间培养。该方法测定的是最低抑菌浓度(MIC)。
b、微量稀释法：在容量约为每孔μL的微量稀释板中进行肉汤稀释法。10、肉汤：用于真菌体外生长的液体培养基。11、接种物：指定量的孢子/分生孢子数（菌落形成单位）悬浮在一定体积中。接种物表示为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。
03
测试流程
总则
在平底孔微量稀释板中进行测试。初步研究数据表明，经组织处理的微量稀释板与未经组织处理的微量稀释板会产生不同的MIC值（未发表的数据）。此外，不同性质的微孔板可能会影响药物结合，从而影响MIC值。这些问题需要进一步研究来证明。在大多数情况下，EUCAST委员公布的用于判断ECOFF和折点设置的MIC分布是用微量稀释法使用经过组织处理过的微孔塑料板的测试结果，因此更有可能产生相似的MIC值。该方法基于每孔μL的抗真菌药物工作液中加入μL接种物。
培养基
推荐RPMI（含L-谷氨酰胺和pH指示剂，但不含碳酸氢盐），补充葡萄糖至最终浓度2%(RPMI2%G)[16，17]。已证明使用2％而不是标准的0.2％葡萄糖浓度能更好的促进生长并判断终点[18]。RPMI培养基的推荐缓冲液是终浓度为0.mol/L，pH7.0的3-(N-morpholino)丙磺酸(MOPS)。RPMI的组成如表1所示。推荐的培养基是含有2%葡萄糖的RPMI(RPMI2%G)，制备成2倍浓度(便于加入接种物后50%[1:1]稀释；见“工作液配制”)。
1、将表2中的成分添加到mL蒸馏水中。
2、搅拌直至组分完全溶解。
3、用1M氢氧化钠在25℃将溶液pH调节至7.0。
4、加水至最终体积为0毫升。
5、用孔径为0.22μm灭菌过滤器过滤器。
6、在4°C以下最长存放6个月。
7、用一份等分的培养基进行无菌检查，重新测试pH（6.9-7.1）并用参考菌株的生长对照进行质量控制。抗真菌药物
一般要求所有抗真菌药物稀释液应选择有资质的生产商规范进行制备。抗真菌药物粉剂必须直接从药品制造商或可靠的商业来源获得。不得使用临床制剂，因为它们可能含有干扰物会影响药敏试验。药物必须提供通用名称、批号、效价、有效期和建议的储存条件。除非制造商另有建议，一般将粉末与干燥剂一起储存在-20°C或更低的密封容器中。理想情况下，应在干燥的环境中进行冷冻前分装，每次使用一份。打开容器之前，请先将容器恢复至室温，以免水在药物粉末上凝结。制备储备液制备抗真菌药物溶液需要考虑到抗真菌药物的效价。制备标准溶液所需的粉末或稀释剂的量可按以下方式计算：抗真菌药物粉末在已通过认证计量机构的校准认可的分析天平上称重。称量的抗真菌药物应超过天平的精度至少10到倍。准备的抗真菌药物储备溶液的浓度至少要比微量稀释板中要测试的最高浓度高倍。供应商应随药品提供有关抗真菌化合物溶解度的信息。除水以外，其他大多数抗真菌药物溶剂见表3。确保药物在冷冻前已完全溶解。几种抗真菌药可能难以溶解会导致人为的MIC升高，在继续操作之前，将试管放在摇床上1小时或更长时间来避免溶解不完全。储备溶液通常不需要灭菌。但是，如果需要，灭菌程序应通过适当的方法进行验证（例如，必须对过滤前后所获得的样品进行分析），以确保在此过程中药物不会被吸附（例如无菌过滤器）或降解。除非药品制造商另有说明，否则将药品溶液少量储存在-70°C或更低的无菌聚丙烯或聚乙烯小瓶中。药物可在-70°C下保存至少六个月而不会明显丧失活性[19]。棘白菌素先前被认为在-70°C下不稳定，但是，研究发现在此温度下至少可以存放6个月[20]。从-70°C取出小瓶，并在溶解的同一天使用。丢弃当天未使用的任何药物。质量控制菌株敏感性的测试结果中（表7）可以确认抗真菌药物的效价显着下降。如果需要，可以对药物进行效价测定。
工作液配制所测试浓度的范围将取决于所测试的真菌和抗真菌药物。浓度范围应包含折点（如果存在）以及质量控制菌株预期的结果。建议使用表3中的药物浓度范围。用RPMI2％G的稀释液制备2倍1mg/L的系列稀释液（表4）。RPMI2%G培养基制备的是最终浓度的2倍，加入等量接种物后做50%的稀释。这种方法允许在蒸馏水中制备接种物。
稀释液应根据ISO建议进行制备（表4）[21]。表4给出了一个使用较小体积制备最终浓度为0.-64mg/L的稀释系列的示例（另请参见表3，以检查每种抗真菌剂所需的溶剂）。
制备工作溶液（2x，最终浓度的2倍）所需步骤如下：
1、从-70°C冰箱中取出抗真菌药物储备管。难以溶解的抗真菌药可能人为的导致MIC升高。在继续操作之前，可以将试管放在摇床上一个小时或更长时间解决这个问题。2、将适当体积的溶剂（溶剂见表3，体积见表4）分配到另外9个试管中。3、遵循表4中所述的步骤，以倍的最终浓度产生一系列稀释液。表4的步骤1中需要分别采用储备浓度为3mg/L或mg/L的类似稀释方案，分别进行0.03-16mg/L和0.-8mg/L的稀释系列。4、将9.9mL2倍RPMI2％G培养基分配到10个试管中。5、取x抗真菌药物稀释液μL分装到是9.9mL培养基（1：稀释度）的10个试管中。培养基试管中溶剂的浓度为1％，抗真菌剂的浓度为2x最终浓度。如果显示出与参考方法一样好的替代方案，则可以使用它们[22]。
微量稀释板制备1、一次性使用96孔微量稀释板（平底，无菌塑料、避免使用高粘结性塑料），容量约为μL。
2、从每个含有相应浓度（2x终浓度）抗真菌剂的试管中，向微量稀释板每列的1至10孔中分配μL。例如，对于伊曲康唑，将含有16mg/L的介质分配到第1列，将含有8mg/L的介质分配到第2列，依此类推，将含有0.03mg/L的介质分配到第10列。
3、向第11和12列的每个孔中分配μL2倍浓度RPMI2％G培养基。
因此，第1至10列的每个孔将含有μL2x抗真菌药物溶液。第11和12列只含2倍浓度RPMI2％G培养基。微量稀释板的贮存微量稀释板密封在塑料袋或铝箔中，可在-70°C以下冷冻保存长达6个月；或在-20°C的温度下冷冻保存不超过1个月[23-25]。棘白菌素类药物的稳定性较差，因此制备的板必须在-70°C（而不是-20°C）下保存（未发表的数据，MCuenca-Estrella）。
微孔板解冻后应立即使用，不得再冷冻。解冻后和接种前将微孔板存放于室温会导致阿尼芬净的MIC增加。
制备接种物
接种物制备的标准化操作对于抗真菌药敏试验结果的准确性和重复性至关重要。最终的接种量必须在1xcfu/mL到2.5xcfu/mL之间。
孢子/分生孢子悬浮液制备方法将分离物在马铃薯葡萄糖琼脂或沙堡弱葡萄糖琼脂或其他能够使真菌充分形成孢子并在35℃下孵育的培养基上传代培养。接种物悬浮液选择新鲜，成熟（2-5天）的培养物制备。在某些情况下，需要长时间孵育才能使培养物充分地形成孢子。用含0.1％Tween20约5ml无菌水覆盖菌落。然后，用无菌棉签小心地收集分生孢子，并用移液管将其转移到无菌管中。或者，可使用潮湿的无菌棉签轻轻接触培养物，并将孢子转移至5ml含0.1％Tween20约无菌水试管中。用涡旋混合器以约2,rpm的速度将悬浮液涡旋15秒。进行适当的稀释，在血细胞计数板进行计数时达到正确的浓度（请参阅注释，针对曲霉属菌种的替代操作方法）。接种制剂也应检查是否有菌丝或团块。如果检测到大量的菌丝（5％的真菌结构），将5mL悬浮液转移到连接到孔径为11μm的无菌过滤器的无菌注射器中，过滤并收集在无菌管中。该步骤去除了菌丝并产生了由分生孢子组成的悬浮液。如果检测到团块，则在涡旋混合器中再次摇动接种物15秒钟。按需要重复此步骤，直到不再遇到团块为止。通过在血细胞计数板中计数分生孢子，用无菌蒸馏水将悬浮液调节至2-5x个分生孢子/mL。如果将曲霉分生孢子悬浮液过滤，则可以使用分光光度计将悬浮液的浓度调节至相当于0.5McFarland（表5）的浓度[26，27]。最后将悬浮液用无菌蒸馏水以1:10稀释，以得到最终工作接种物2–5xcfu/mL[26-29]。
接种微量稀释板为了保持有活性的分生孢子浓度，应在制备接种菌悬液后30min内接种微量稀释板。涡旋接种悬浮液，并在微量稀释板的每个孔中接种μL2-5xcfu/mL的分生孢子悬浮液，不要接触孔内液体。控制最终药物浓度和接种菌悬液浓度（微孔内菌悬液浓度1x–2.5xcfu/mL）。第11列用于生长对照，含有μL相同的接种菌悬液和μL无抗真菌药物的培养基。第12列加入μL无菌蒸馏水，作为对培养基和蒸馏水（不含抗真菌药物培养基）的无菌质控。每次测试时，均以相同的方法进行质量控制。为了进行质量控制，应进行生长计数，以确保测试孔的浓度在1x–2.5xcfu/mL之间。10μL接种悬浮液在2ml含0.1％Tween20的无菌蒸馏水中稀释，2,rpm涡旋振荡。然后将μL的悬浮液平铺到合适的琼脂平板（沙堡弱葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂）的表面，孵育24-48h或直到可计数菌落。理想的菌落计数应控制在至个。另一种替代方法是，用μL含0.1％Tween20的无菌蒸馏水中进一步稀释μL悬浮液，涡旋振荡，取μL菌悬液平铺培养计数，10-50个菌落为可接受。当实验室较少进行药敏试验，或怀疑有无法解释的结果时或定期地（根据实际需要），对每个菌株都进行此项测试。
微量稀释板的孵育在空气环境中于34-37°C静止孵育微量稀释板。使其充分生长，通常毛霉菌在生长24h读取结果；其他霉菌应在48h读取。在极少数情况下，将需要进一步的24小时孵育期，以使对照孔（例如赛多孢菌）充分生长。不建议孵育时间超过72h。
结果判读
通过目测读取每个孔的生长程度，记录终点。除棘白菌素的抗真菌药物的MIC：肉眼未见明显生长的药物浓度为MIC值。忽略微孔底表面和“跳孔”（在阳性生长孔之间没有生长的单个孔）中的单个菌落。记录时，建议使用水平黑白相间纸作为板的背景，因为只有当微孔没有生长时，通过凸起的底板观察时会显得清晰(图1)。棘白菌素最低有效浓度（MEC）终点：是在该浓度下观察到异常的、短的和分枝的菌丝簇，与生长控制孔中看到的长的、不分枝的菌丝结构形成对比(图2)。在某些情况下，这可能会被肉眼记录为导致宏观变化的丝状生长的最低药物浓度，类似于在阳性对照孔中观察到的微集落或颗粒生长(被忽略)，尽管这种情况很少见。如果不是这样，就有必要在显微镜下检查孔中的培养物，以观察药物诱导的形态学变化，或者可以使用倒置显微镜来观察孔内的变化。
结果解释EUCAST建立了两性霉素B、艾莎康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和曲霉菌属的折点，相关的背景文献在出版物和EUCAST网站[13，14]。目前还没有可用的数据支持棘白菌素MEC与治疗结果之间的相关性。在没有折点的情况下对其他霉菌的MIC进行解释具有挑战性，应非常谨慎，要考虑到任何可用的数据，包括临床经验，治疗期间的药物暴露等。然而，MIC仍可能提供一些有关敏感性的信息，以及重要的是为其他霉菌确定MIC的信息，是未来ECOFF和折点选择的重要前提。
质量控制
质控是确保结果质量的一种手段，CLSI[30]进行了详细描述。常规质量控制使用质控菌株。
质控菌株理想情况下，质控菌株的MIC应该接近所测试值的2倍系列稀释度的中间值，并且抗真菌药物的敏感性稳定。根据这些标准选择推荐的对照菌株（可在EUCAS网站
